El uso de enzimas es una de las principales herramientas para el desarrollo de tecnologías sustentables ya que requieren temperatura y presión moderadas, reducen el consumo de solventes orgánicos y evitan los problemas relacionados al uso de catalizadores metálicos. Las lacasas (EC 1.10.3.2), enzimas que forman parte del sistema enzimático ligninolítico extracelular de los basidiomicetes de la podredumbre blanca, destacan entre las enzimas con mayor campo de aplicaciones, dado que su baja especificidad les permite actuar sobre un amplio rango de sustratos. Considerando su aplicación a nivel industrial, su inmovilización en soportes insolubles representa una importante herramienta, permitiendo: reutilizar el biocatalizador (disminuyendo los costos del proceso); facilitar el control de la reacción (por remoción de la enzima inmovilizada del medio de reacción), diseñar procesos continuos y en muchos casos aumentar la estabilidad enzimática. El empleo de materiales lignocelulósicos para inmovilizar biocatalizadores presenta varias ventajas: su bajo precio, su amplia distribución, son un recurso renovable y biodegradable y poseen regiones hidrofílicas e hidrofóbicas capaces de interactuar con la enzima. El uso del material sólido generado como subproducto en la producción de Bioetanol de segunda generación (B2G) para la inmovilización de proteínas representa una novedosa y sustentable opción de valorización. Entre las biomasas de mayor interés para la producción de bioetanol en nuestro país se encuentra la madera de Eucalyptus spp., el árbol de madera dura más plantado del mundo y particularmente en el Uruguay debido a su rápido crecimiento y alta calidad de la madera. Nuestro grupo de trabajo ha iniciado una línea de investigación centrada en obtener biopolímeros a partir de residuos lignocelulósicos aptos para ser utilizados en la inmovilización de lacasas para su aplicación en la degradación de disruptores endócrinos. En el trabajo realizado se comprobó que los biopolímeros generados como sub-producto de la producción de B2G a partir de biomasa de Eucalyptus son adecuados para generar la matriz sólida en la inmovilización por el método de entrapamiento de lacasa fúngica. En este trabajo se plantea buscar alternativas relacionadas al material y el método de inmovilización utilizados, para obtener un biocatalizador más activo y con mayor posibilidad de re-uso. En particular, se propone utilizar el método de inmovilización por uniones covalentes en un soporte sólido preformado. Se trabajará en primer lugar con el soporte formado a partir de celulosa microcristalina y luego se evaluará el uso del residuo sólido lignocelulósico que se busca valorizar. Actividades a desarrollar: a) Obtención de soportes sólidos en base a celulosa comercial y biopolímeros del residuo de la producción de B2G. b) Inmovilización covalente de lacasa del basidiomicete Dichostereum sordulentum en los dos soportes obtenidos. c) Evaluación del efecto de distintas variables que afectan el rendimiento de inmovilización, como el tiempo de la reacción de oxidación del soporte, la carga de enzima aplicada y el tiempo de contacto de enzima-soporte. En este trabajo el pasante podrá adquirir experiencia en el área de biocatálisis y en particular en la metodología de inmovilización de enzimas. Es necesario que el estudiante cuente con la unidad curricular Bioquímica Opción 3 de Facultad de Química aprobada o con formación equivalente de otro centro de estudio.
Seguir leyendo...
En la vinificación, las levaduras cumplen un rol fundamental. Además de ser responsables de llevar a cabo la fermentación, generando principalmente etanol y dióxido de carbono, también son capaces de metabolizar y producir numerosos compuestos orgánicos que tienen un impacto determinante en el aroma y el sabor final del vino. Las especies Saccharomyces cerevisiae es la cepa fermentadora por excelencia y utilizadas tradicionalmente para la producción de vinos. No obstante, el continuo crecimiento del sector vitivinícola y las exigencias de los consumidores han orientado los esfuerzos hacia la producción vinos con características singulares y diferenciales. En este punto, las levaduras no convencionales han cobrado gran protagonismo como herramientas para el desarrollo de nuevos productos. Numerosos estudios han demostrado que el uso de levaduras autóctonas no convencionales, que forman parte del microbiota de la uva, permite lograr vinos con mayor complejidad aromática, entre otros atributos. El desarrollo de estos caracteres específicos de aromas depende en gran parte de la existencia durante la elaboración del vino, de enzimas capaces de actuar eficientemente sobre los sustratos glicosídicos existentes, generando compuestos volátiles de interés (González-Pombo et al., 2011). Existe una fuerte evidencia de que, en contraste con la mayoría de las especies Saccharomyces, muchas levaduras no-Saccharomyces producen glicosidasas intra y extracelulares y las mismas podrían tener un efecto significativo en el desarrollo del aroma de los vinos generando aromas más intensos debido al aumento en la concentración de monoterpenos y norisoprenoides (de Ovalle et al.,2021; Wang et al., 2011). La selección adecuada de dichas levaduras autóctonas podría permitir la producción de vinos singulares sin depender de fermentos comerciales para vinificación, manteniendo las propiedades diferenciales de su propia zona y la preservación de su biodiversidad natural. Desde hace varios años el grupo que lidera la Dra. Paula Gonzalez Pombo del Área Bioquímica del DepBio, explora la diversidad de nuestro patrimonio de cepas nativas Saccharomyces y No-Saccharomyces para la selección de cepas y enzimas con adecuadas propiedades para su aplicación enológica (González-Pombo et al., 2018; de Ovalle et al., 2021). Nuestro grupo cuenta actualmente con una colección de cepas de levaduras provenientes del viñedo Tannat de la región de Maldonado y ha realizado la identificación molecular y la caracterización enológica de algunas de las cepas (Morera etal.,2022). En el presente trabajo se propone evaluar diferentes especies de levaduras no convencionales aislados de ecosistemas vínicos, como productoras de actividad glicosidasa. En base a esto se realizarán estudios de fermentación en mosto de uva sintético con dichas cepas para evaluar su posible contribución a la mejora del aroma y a las características regionales. En el contexto actual, donde se busca destacar la singularidad de los vinos de cada región, la colección de cepas generado actualmente por nuestro grupo es una gran herramienta que nos permitirá seleccionar cepas productoras de actividad glicosidasa y con buenas propiedades enológicas, como candidatas potenciales para ser utilizadas en fermentaciones. Para llevar esto a cabo se propone en este trabajo la caracterización enzimática de los aislados de levaduras pertenecientes a diferentes géneros no-Saccharomyces, como primer paso para seleccionar aquellas cepas con excelentes propiedades y así evaluar la performance de las mismas en fermentaciones de mosto de uva sintético. El perfil requerido del estudiante para realizar este tarbajo requiere conocimientos de Microbiologia y Bioquimica. Esta enfocado a estudiantes de las carreras de: Químico Farmacéutico, Bioquímico Clínico, Ingeniero Químico, Ingeniero Alimentario, Licenciatura en Bioquímica, Licenciatura en Biología, Licenciatura en Biotecnología, o formación equivalente.
Seguir leyendo...
Los núcleos indólicos son motivos estructurales abundantes en productos naturales con actividad biológica, lo cual motiva el interés en su diversificación estructural tanto para el desarrollo de nuevos compuestos bioactivos como para el estudio de los mecanismos de acción de aquellos ya conocidos. En particular, muchas sustancias psicodélicas son derivadas del triptófano, entre las que se encuentran los alcaloides del indol. El interés en este grupo de compuestos deviene de las investigaciones que se han retomado en los últimos años a nivel mundial y que han evidenciado su potencial aplicación en el tratamiento de diversas enfermedades mentales como ansiedad, depresión, estrés post-traumático, y adicciones. En las estructuras de estas moléculas se destaca la presencia de átomos de oxígeno y grupos metilo como sustituyentes sobre distintos átomos, lo cual sugiere la importancia de buscar herramientas que permitan introducir estas modificaciones en distintas partes de la estructura central, ya sea para proponer una síntesis más eficiente o para generar diversidad estructural, que sea base para profundizar en el estudio de estas sustancias. En este sentido, las estrategias biocatalíticas resultan en una alternativa atractiva debido a sus ventajas asociadas, entre las que se destacan: la regio- y estereoselectividad de los biocatalizadores junto con su capacidad de introducir ciertos grupos funcionales en átomos de carbono no activados (que es ampliamente deseable en el área de química fina) y la posibilidad de obtener procesos que cumplan con principios de química verde, ya que su impacto ambiental es considerablemente más bajo que el de muchos de los procesos utilizados tradicionalmente en química sintética, (las reacciones pueden llevarse a cabo a temperatura ambiente y presión atmosférica), disminuyendo a la vez el gasto energético y los problemas de inestabilidad de sustratos y reactivos. En la búsqueda de la diversificación estructural, la metilación puede afectar drásticamente las propiedades bioquímicas y biofísicas de un compuesto (estabilidad, solubilidad y bioactividad, entre otras). Estos cambios justifican el interés en la generación de estrategias sintéticas eficientes, en particular en el campo del desarrollo de nuevas moléculas con potencial uso como fármacos. En las rutas biosintéticas, las metilaciones suelen ser “modificaciones tardías”, donde es necesario atacar nucleófilos específicos en moléculas complejas, muchas veces altamente funcionalizadas o cíclicas, lo que representa una dificultad para la síntesis tradicional, fundamentalmente asociada a la falta de regio y estereoselectividad en los productos obtenidos. En este sentido, las metiltransferasas han sido utilizadas para la síntesis de múltiples compuestos, existiendo antecedentes de su aplicación a la alquilación de compuestos aromáticos polifuncionalizados. Dentro de las 6 clases de metiltransferasas que han sido identificadas, las más comunes pertenecen a la familia de metiltransferasas dependientes de S-adenosil metionina (SAM). Dentro de estas, las metiltransferasas (MTs) de productos naturales catalizan la adición selectiva de grupos metilo sobre átomos de S, N, O o C, para generar una diversidad de compuestos, y se clasifican según el átomo que modifican. SAM es un reactivo químicamente complejo, relativamente inestable y costoso, lo que muchas veces restringe el estudio y el uso de las metiltransferasas. Afortunadamente en los últimos años se han desarrollado sistemas de regeneración del cofactor SAM. Uno de ellos está basado en la acción de una haluro metiltrasnferasa (HTMT) capaz de producir SAM a partir de S-adenosil homocisteina (SAH) e ioduro de metilo, ambos sustratos económicamente accesibles. La optimización de un sistema de regeneración del cofactor SAM permitirá en un futuro integrar de manera eficiente este cofactor con metiltransferasas, potenciando así su capacidad para catalizar reacciones de metilación de manera sostenida. En este contexto proponemos estudiar la expresión de HMT de Chloracidobacterium thermophilum de forma heteróloga en E. coli, su purificación y caracterización bioquímica. El estudiante interesado deberá tener aprobadas las unidades curriculares Bioquímica opción III (15 créditos) y Microbiología General (12 créditos) dictadas en Facultad de Química, o tener formación equivalente de cursos dictados en otras instituciones.
Seguir leyendo...
Las glicoproteínas median numerosos procesos fisiológicos, por lo que patrones alterados de su glicosilación está asociado diversas patologías. Por otra parte, el rol de los glicanos en estos procesos ha llevado a la expresión recombinante de glicoproteínas y su uso como biofármacos. El control del perfil de glicosilación es esencial para asegurar su seguridad y eficacia. La elucidación estructural de los glicanos es fundamental para entender su rol en procesos fisiológicos y patológicos facilitando el diseño de métodos de diagnóstico y tratamientos terapéuticos. Una de las estrategias más frecuentes para el estudio de los N-glicanos es su remoción enzimática catalizada por la enzima péptido-N-glicosidasa F (PNGasa F) para su posterior análisis. La PNGasa F de Elizabethkingia miricola es la enzima más utilizada para estos propósitos. Esta puede ser adquirida comercialmente, lo cual trae a aparejado obligatoriamente su traslado en frio, pago de flete, seguro y gastos de importación, y aceptar el riesgo de que la enzima llegue inactiva. El presente trabajo busca solventar los diferentes inconvenientes asociados a la adquisición de la enzima, mediante el diseño y desarrollo de sistemas de expresión de la enzima soluble basados en cepas de E. coli. Una vez desarrollados dichos sistemas se llevarán a cabo ensayos de expresión y se evaluará el proceso de purificación de la enzima de interés según el sistema de expresión utilizado. La propuesta está pensada para ser llevada a cabo por estudiantes avanzados de las carreras de UdelaR que cuenten con la aprobación de los cursos de Bioquímica y Microbiología respectivos a sus carreras. Al finalizar esta experiencia el estudiante logrará comprender el proceso de diseño de sistemas de expresión y habrá adquirido experiencia en el manejo de cultivos bacterianos para la producción heteróloga de proteínas. Además, podrá poner en practica diversas técnicas relacionadas con la purificación de proteínas y su control de calidad. Todo el trabajo se desarrollará en el Área Bioquímica de la Facultad de Química y estará bajo la dirección y supervisión de los Dres. Cecilia Porciúncula y Agustín Castilla, docentes de dicha Área.
Seguir leyendo...